明胶酶谱试剂盒使用注意事项大总结！

本试剂盒采用酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一种广为使用的、基于 SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1 和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后 取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。

凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景， 但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能 同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学 反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性，检测灵敏度~1nM。试剂 盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。

试剂盒使用注意：

1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6.细胞样本用PBS 5倍体积震荡裂解,估算细胞的体积，然后加入5倍体积的PBS，涡旋振荡15-30s,而后静置或低速离心.或者手动震荡。

染色步骤：

1. 此染色液即为工作液，使用时直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝 胶，并缓慢摇动2h；

2. 倾去染色液，用脱色液冲洗凝胶；

3. 以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2h，倾去脱色液，再加入新脱色液进行脱色，直至获得清晰的蓝色的条带 和干净的背景（通常此过程需要2～4h，也可脱色过夜至清晰的蓝色的条带和干净的背景）；

4. 对凝胶进行分析和照相，凝胶可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置（P2000）对 凝胶进行处理后保存。 安全性：含有甲醇，无特殊毒性，按一般化学品操作规程处理。

明胶酶谱试剂盒使用注意事项大总结！