显色基质鲎试剂盒操作方法！

用途：

显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate ， CE TAL )用于体外细
菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。

原理：
鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、
凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，
引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多
肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身
的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

检测限：
按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml 和0.01EU/ml -0.1EU/ml 两个区间( 反应时间T 1 和T
2 见出厂检验报告) 。

用法：
1. 材料和设备
1.1 试剂
鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反
应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。
1.2 器材
无热原试管、无热原吸头、旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架、恒温水浴箱
（37±1℃）、分光光度计。
注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。
玻璃器皿可经 250℃干烤至少 60 分钟去除热原。

2. 供试品的贮存与预处理
备注：若供试品为血液类，请参照我厂配套血液相关处理试剂使用说明书。
2.1 供试品的 pH 值应在 6 - 8 之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N 氢氧化钠或 0.1N 盐酸
调节。
2.2 若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质，处理参见【供试品的干扰试验】。
2.3 若供试品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生 G 因子旁路反应，干扰内毒素检测），需选
用特异性鲎试剂（我公司提供）。
2.4 若供试品为一些抗菌塐如头孢类抗菌塐和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化
显色，需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒（我公司提供）。
2.5 若供试品的本底吸光度值大于 0.5，必须对供试品进行稀释后再检测。
2.6 若供试品颜色较深(例如溶血)，或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质)，必须设置供
试品空白管以扣除供试品自身的颜色本底。供试品空白管不加入鲎试剂，以等体积鲎试剂的溶
剂(该处为细菌内毒素检查用水)代替。其余操作同供试品管。

实验操作
取无热原试管，加入 100μl 细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。再加入 100μl 鲎
试剂溶液，混匀，37ºC 温育 T1 分钟。温育结束，加入 100μl 显色基质溶液，混匀，37ºC 温育 T2
分钟。温育结束，加入 500μl 偶氮化试剂 1 溶液，混匀，加入 500μl 偶氮化试剂 2 溶液，混匀加入
500μl 偶氮化试剂 3 溶液，混匀，静置 5 分钟，于 545nm 波长处读取吸光度值。

干扰试验，步骤如下：
1. 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒
素浓度，配制含λm 内毒素的供试品阳性对照，测量出该溶液的内毒素浓度，称为 Cs；
2. 测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度，称为 Ct；
3. 计算该试验条件下的回收率 R＝（Cs–Ct）/λm×
4. 当 R 在 50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
5. 当 R 在 50%～200%之外，需对供试品进行系列稀释(稀释倍数不得超过大有效稀释倍数 MVD)
或进行其它处理消除干扰，每一稀释溶液都重复步骤 1-3，直到内毒素的回收率 R 在 50%～200%
之间。选择回收率 R 接近 的稀释倍数进行内毒素检测。

显色基质鲎试剂盒操作方法！