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 环酰苷放免试剂盒操作说明书

CAMP RIA KIT

一、药物供应试验

     1.BSA 1瓶（用于配制0.2%BSA的醋酸缓冲液）：溶于 15  毫升50mM PH 4.75

的醋酸缓冲液（配法见后）

2.乙酰化剂试剂：使用前将三乙胺和醋酐混匀即可(三乙胺和醋酐各一瓶)

3.¹²⁵I- CAMP1瓶：使用时用50 mM醋酸缓冲液 10 毫升稀释标记品（约2万CPM左右/0.1ml）.

4. CAMP标准1瓶：取 100  微升，用 2.6  毫升50 mM醋酸缓冲液稀释为2pmol/0.1ml，然后倍比稀释成8个浓度点：1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031、0.016、0.008pmol/0.1ml

(B1～B8)。

5. CAMP抗血清一瓶：使用时用含0.2%BSA的醋酸缓冲液13 毫升溶解

6.羊抗兔IgG血清1瓶，每瓶用 10 ml生理盐水溶解即可，4℃保存。

7.正常兔血清1ml，用 10 ml生理盐水溶解即可4℃保存。

8、EDTA抗凝剂1瓶。

9、醋酸缓冲液1瓶： 1：4稀释（1份该液加3份蒸馏水）。

二、操   作

                          CAMP  RIA 加液程序    （单位： ul ）

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              试   剂      T     NSB      B₀     S₁~S8      样  品

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              醋醋缓冲液  ——    200      100     ——      ——

              标 准 品    ——    ——    ——     100       ——

              样        品    ——    ——    ——    ——       100

              乙酰化试剂  ——      5          5       5         5

              抗  血  清    ——    ——     100     100       100

             ¹²⁵I-CAMP  100     100      100     100       100

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                                  充分混匀，4℃   过夜。

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              正常兔血清   100     100      100     100      100

              羊抗兔IgG    100     100      100     100      100

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                                  充分混匀，4℃   过夜。

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  摇匀，室温放置2～3h, 3000rpm离心15分钟，吸去上清，在γ计数器上测定沉淀CPM数。

三、计算

      NSB为非特异结合管，标准曲线及样本测得值均需减去NSB值，以B/B0计算标准及待测样品结合百分率，在半对数纸上绘制标准曲线，并查出样品值。或由γ计数器预先编制得程序，直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度。或从EXEL表格中的直线回归方法计算。所得结果乘以稀释倍数即可。

四、样品收集

1、需配试剂

1）  EDTA抗凝剂。取9.3克EDTA二钠盐加入1mol/L   NaOH溶液25ml，溶解后加水到50ml.。

2）  50mMPH4.75醋酸缓冲液，（含4mM EDTA）：取27.22克NaAc . 3H₂0溶于1000ml蒸馏水，即为0.2M  NaAc，用冰醋酸配制0.2M醋酸，然后取410毫升0.2M HAC和590毫升0.2M NaAc混匀，测PH值调到PH 4.75，然后每1000毫升溶液加入5.95克 EDTA 二钠盐溶解即可.此溶液为200 Mm  pH 4.75 的醋酸缓冲液，EDTA为16mM。使用时将该液1：4稀释。（1份该液加3份蒸馏水）即成50mM  pH4.75醋酸缓冲液，含EDTA 4Mm.

2、血样本处理

1）  取静脉血1～2ml，注入含DETA抗凝剂50ul的试管中，摇匀，一小时内离心4℃，2000rpm离心10min，分离血浆， —20℃保存，严禁反复冻融。

2）  血浆处理：取0.1ml血浆加入2ml无水乙醇，振摇1分钟，静置5分钟，3000转/分离心10分钟。将上清液到入指形管或青mei素小瓶，残渣再加入75%乙醇1ml，匀浆，3000rpm离心10分钟。合并上清液，于60℃烤箱中吹干，残渣放于4℃保存。测量时用1ml醋酸缓冲液溶解，然后取0.1ml测量，此时稀释倍数为100。结果×100即为pmol/ml.

3、组织样品处理

取组织50毫克左右放入盛有2ml冷的50mM  PH4.75醋酸缓冲液的试管内(冰浴)，匀浆，加入2ml无水乙醇，混匀，静止5分钟，3500转离心15分钟，将上清液收集在青mei素小瓶内，再用75%乙醇2ml洗沉淀，匀浆分散，混匀，3500转离心15分钟。合并上清液,60℃烤箱中吹干，残渣放于4℃保存。测量时用1ml醋酸缓冲液溶解，然后取0.1ml测量。

  4、对于血、组织样本，不同血样或组织中的CAMP或CGMP含量不同，测试前预实验确定样品稀释度。

五、正常人血浆参考值：

CAMP:23.1±7.7pmol/ml

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