一提起miRNA的发现，新一代测序就笑了。RNA-seq这种新技术发现，可鉴定SNP、突变和新的miRNA。RNA-seq通常被视为一种筛查技术。就目前而言，它以一种半定量但极透彻的方式鉴定样本中的所有序列。当然，它价格不菲，数据分析繁复，并非全部实验室都有机会使用。

qRT-PCR这种经典技术仍然是miRNA表达谱分析的方法，因为它符合您的所有期望：样本量低、灵敏度高、特异性好以及动态范围广。在单次运行中，从10到10⁷个拷贝的miRNA靶标都能准确定量。一般而言，每次分析需要1 ng总RNA，而miRNome的分析需要1 μg RNA。对于细胞系的分析，这点RNA当然是小菜一碟，但并非所有研究都那么幸运。分选后的细胞、激光捕获组织、循环肿瘤细胞如此珍贵，未必能实现。在此，我们就介绍一个基于PCR的系统，它能将miRNome分析所需的样本量降低了几个数量级，同时带来了出色的重复性和性。

miRNA的预扩增

这就是来自QIAGEN的miScript® PreAmp Primer Mixes 。尽管市场上也有一些方法能预扩增miRNA，但miScript PCR System是*一种技术，包含了真正通用、小RNA特异的cDNA合成反应。

在这种技术中，miRNA被大肠杆菌poly A聚合酶加尾，接着以oligo dT为引物合成cDNA。这确保了所有miRNA都能无偏向地转化成cDNA。更重要的是，这包括了过去未曾鉴定的miRNA，让您在发现了新的miRNA靶标时能随时返回到原先保存的cDNA样本。在此，RNA的用量不是很关键，但QIAGEN建议cDNA合成反应包含10 ng RNA（相当于300个细胞）。每个cDNA合成反应可用于10次预扩增反应，每次1 μl（相当于1 ng RNA或30个细胞）。更多RNA当然也可以，但没有必要。更少RNA也并非不行，但若少于3个细胞，取样的差异会导致中等或低表达miRNA的结果发生变化。

预扩增过程是一个高度多重的PCR，以96或384个分析的形式开展，这对应了QIAGEN预开发的96-和384-分析的miScript miRNA PCR Array。经过12个循环的预扩增，其产物可与实时定量PCR预混液混合，用于miRNA表达谱分析。无论是10-20个拷贝的靶标，还是107个拷贝的靶标，如今都增长了4个数量级。这下，您再也不用担心样本量不够了。FFPE组织，血液、尿液等体液都能采用这种办法预扩增。

样本量是够了，但预扩增会不会影响miRNA表达谱本身呢？相信这是大家zui关心的问题。如此大量分析的同时开展，确实是个难题，但QIAGEN通过一些设计特征使其成为可能。首先，由于miScript PCR System采用通用的3’ PCR引物，预扩增引物库的复杂度立即下降50%。其次，所有的扩增子都有着相同的大小和非常接近的Tm，这大大有利于多重反应的无偏向扩增。zui后，cDNA合成反应的试剂严重限制了cDNA副反应，这样背景cDNA极少，而预扩增反应中的背景也极低。

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