ELISA 标准操作及技术服务的常见问题

ELISA 标准操作要点

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于 1.5μs/cm。

标本的采取和保存

大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清 IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 抗凝不*的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素

抗凝剂。

ut off 值附近血清的处理

1.cut off 值附近的值是客观存在的

cutoff 值指经过大量临床调查后自行制定的判断阴阳性的界限。Cut off 值附近的值客观存

在基于以下原因：大量临床阴性样本 A 值呈正态分布；这些阴性样本 A 值是由低到高的连

续曲线；cutoff 值是这个连续曲线上的截断值。

1.1 正常血清 A 值的正态分布

95.46％

µ-2σ µ µ+2σ 图一

当试剂盒研发完成后，需要进行大量的临床样品的考核。其中阴性血清的 A 值呈正态分布，大约 95％的阴性血清值与平均值相近，而有 5％的阴性血清则明显低于或高于平均值，这是 cutoff 值可根据 95％的置信限来确定。若试剂盒的特异性很好，可用 98％作为置信限来确定 cutoff 值。但不论是选择多少的置信限，总存在置信限以外的区域，该区域的部分样品 A 值会高于 cutoff 值，从统计上说是无法避免的。1.2 正常血清 A 值的连续分布经过大量的临床调查会发现，正常血清的 A 值是一条从小到大的连续曲线。在这条连续的曲线上，经过计算选取一点作为 cutoff 值，这一点之下为阴性，之上为阳性，因此 cutoff 值附近的值是必然存在的。

2.怎样对待 cutoff 值附近的血清

2.1 本公司试剂盒有很好的敏感度和特异性，不提倡设置灰区，坚持按照说明书要求，大于等于 cutoff 的为阳性。

2.2 某些检验单位有划灰区的习惯，灰区一般是在相应的 cutoff 以下 8％－10％范围内，国家并没有一定的规定，对于一定要设置灰区的单位，本公司建议在我们的 cutoff 值以下 10％为灰区。值得注意的是本公司的 HCVcutoff 是变化的，所以灰区也应是变化的。

2.3 对于可疑样本可采用多次数检验的方法作为阴阳性判断的依据。如进行 5 此重复性试验，有 3 次为阳性，2 次为阴性，判断样本为阳性